Jak se připravují genetické, kovidové vakcíny - II.část

z pohledu biotechnologie.   zelená barva pro bakterie, fialová barva pro viry v celém dokumentu

BAC – bacterial artificial chromosom – bakteriální umělý chromozom
DNA- deoxyribonukleová kyselina 
ds – double strand, dvouvláknová 
exprese genů – vyjádření genetické informace, její použití 
GMO – geneticky modifikované organismy 
inzerční mutageneze – úsek DNA se vnese na místo do jiné molekuly DNA, kde vytvoří trvalou a nezvratnou negativní změnu 
konjugace – spojení 
protein - bílkovina, komplexní molekula skládající se z několika polypeptidových řetězců 
mRNA - messenger (informační) ribonukleová kyselina 
lipozom - je umělá kulovitá struktura vytvořená z lipidové dvouvrstvy 
RNA – ribonukleová kyselina 
replikace – tvorba kopií molekuly 
rekombinance - přeskupení DNA materiálu mezi již existujícími formami genů za vzniku nových 
rekombinantní – připravené, vyrobené geneticky modifikovaným organismem 
ribozom – komplexy ribozomální RNA a bílkovin v cytoplazmě buňky, kde dochází k translaci/překladu 
ss- single strand, jednovláknová 
transkripce– přepis genetické informace z DNA do RNA 
translace– překlad genetické informace z RNA do bílkoviny (polypeptidů) 
transgenóze- je proces vložení cizího genu 
YAC– yeast artificial chromosom - kvasinkový umělý chromosom
+ sense/pozitivně orientované vlákno RNA
 - antisense/negativně orientované vlákno RNA

Modré pochody z obrázku č. 1 jsou vlastní všem buňkám, červené pochody jsou specifické pro určitý typ partikule/buňky. Virus není buňka, je to partikule a zároveň intracelulární (vnitrobuněčný) parazit. DNA virů (latentních jako např. Herpes viry) je schopna se napojit na naší DNA v buňce a perzistovat tam (jako provirus). Jen v momentě oslabení organismu se začne znovu vyjadřovat virová informace a začnou se tvořit nové partikule, odborně se tomu pochodu říká přechod z latentní fáze do lytického cyklu (př. orální opar). DNA je stabilnější a hůře podléhá změnám, protože je ve většině případů dvouvláknová. RNA je křehčí (musí se s ní neustále pracovat na ledu), protože v rozmezí sekund podléhá rozpadu – je rozložena a také velice snadno podléhá změnám a rekombinaci s jinou RNA podobného složení (viz RNA viry chřipky). Většinou je jednovláknová.                                                                                

DNA a RNA viry ale mají různé typy nukleových kyselin – jednovláknové a dvouvláknové RNA, dvouvláknové a jednovláknové DNA, segmentované, nesegmentované s kruhovitými či lineárními molekulami. A dle toho jaká je nukleová kyselina, dochází k jiným procesům při napadení buňky virem.                                                                Mimochodem, toto je jeden z faktů, díky němuž já věřím, že evoluce/příroda vždy rozjíždí změny různými způsoby a to, co je dokonalé, tak se v čase udrží a co ne, zanikne a my, či vědci vím jen o jedné cestě, která se ukotvila  …ale zase zpět                Viry se dále rozdělují dle toho, kdo je jejich hostitelem (bakterie, rostliny, živočichové, určité buňky jako př. HIV), dle tvaru a struktury virové partikule, a ještě dle toho, zda mají obal původně vzatý z hostitelské buňky nebo ne. Dle nukleové kyseliny (DNA, RNA, ss, ds, pozitivně či negativně orientovaná) se liší posléze pochody a procesy v hostitelské buňce a dále se liší přítomnost a/nebo potřeba enzymů, které jsou potřeba k procesu množení. Jednotlivé skupiny virů, které jsou patogenní pro člověka, patří do pěti hlavních skupin virů, každá má odlišné mechanismy a procesy v hostitelské buňce viz obr. 2. Proto léčba chorob způsobené viry v rámci jedné skupiny je podobná nebo stejného typu, ale vůbec nelze použít na léčbu nemocí způsobené viry z ostatních skupin.

Např. covid a chřipka: SARS, MERS apod. viry patří do stejné skupiny jako Ebola a Marburg virus, což je skupina IV. Jejich procesy mají k sobě blíž než procesy chřipkových virů, které patří do skupiny V, viz obr 2. či popis "pod". Nelze tedy použít stejnou léčbu – antivirotika na chřipku a covid-19. Detailněji, jedna antivirotika jsou zaměřena na funkci enzymu pro množení viru z jedné skupiny, ne jiného z jiné skupiny, protože u druhé skupiny prostě enzym není a není potřeba. Antivirotika pro covid-19 byla vyvinuta od antivirotik na Ebola virus.

Obr. 2. Rozdělení lidských virových patogenů:

I. skupina jsou ds DNA viry s dvouvláknovou molekulou. Ke svému množení potřebují enzymy, ribozomy a ostatní molekuly z daných hostitelských buněk – pro všechny kroky potřebují buněčný aparát. Patří k nim viry oparů, pravých neštovic, viry dýchacího systému, průjmů, hepatitidy.

II. skupina jsou ssDNA s jednovláknovou DNA. Mají vlastní enzym na replikaci/dvojení DNA: Jinak potřebují enzymy, ribozomy - proteosyntetický aparát buněk. (virus 5. dětské nemoci viz první část)

IV. skupina jsou významné +ss RNA viry s jednovláknovou RNA. Potřebují jen ribozomy v cytoplazmě na přepis. +ss RNA má funkci mRNA (informační) k překladu/translaci pro tvorbu enzymu/-ů (virového), který/é je/jsou odpovědný/é za množení viru (viry obrny, eboly, covidu-19)

V. skupina jsou -ssRNA viry s jednovláknovou RNA. Jednovláknová RNA se nejdříve musí zreplikovat/zdvojit na svoji + formu, aby byla použita k překladu k tvorbě virových proteinů. Obsahují vlastní enzymy pro replikaci RNA. (viry chřipky, vztekliny)

VI. skupina jsou +RNA viry s reverzní transkriptázou (specifický enzym) – retroviry. +ss RNA se přepíše reverzní transkriptázou do DNA (př. virus HIV) a posléze virus použije veškerý buněčný aparát k tvorbě proteinů a k tvorbě nových virových partikulí.

Na obrázku nejsou další dvě skupiny, ke kterým nepatří významné lidské patogeny skupina III. dsRNA a skupina VII. ds DNA gapped.

"Osobně se domnívám, že skutečnost, že SARS-COV2 a MERS a další příbuzné viry patří do stejné skupiny s Ebola, Marburg a virem obrny, je důvod, proč i odborníci přistupují k intenzivnějším preventivním opatření než je tomu u chřipky".

mRNA vakcíny

Práce s mRNA začíná její izolací nebo izolací DNA virového úseku, který kóduje imunogenní bílkovinu )základ vakcíny), a izolací enzymu, který RNA z viru replikuje/dvojí. Izolace DNA a RNA je nejjednodušeji proveditelné tzv. vysolováním – užijete alkoholy a jiné chemikálie postupně. Dále přepíšete DNA (když je to DNA) na mRNA pomocí komerčně dostupných enzymů. Na molekule RNA provedete chemickou změnu uridinů na N-methyl-pseudouridiny, aby dané molekuly nevyvolávaly imunitní reakci organismu proti vakcíně. Použitelná mRNA (vakcína) se zavede do lipsosomu (dříve), dnes do lipidové nanopartikule a zavede se do těla. V těle se nedostává do jádra a překládá/translatuje se buněčným aparátem do imunogenní bílkoviny, která se dostává na povrch buňky a nechavá imunitní mechanimy, aby si proti ní vytvářely imunitní odpověď. Tedy v našem případě proti Spike proteinu SARS-Cov2 viru. Viz obr.3: schéma tvory kovidové mRNA vakcíny. Mechanismus pro přípravu mRNA se již používá k léčbě nádorového onemocnění. 

Příklady mRNA vakcín:

konjugovaná vakcína sérotypů A, C, W-135 a Y, bakterie Neisseria meningitidis, což je další typ viz I.část

mRNA-1273 Moderna, virus SARS-CoV2 – mRNA kódující bílkovinu/protein Spike je chráněna z lipidových nanočástic (jako mýdlová bublina). Jakmile se partikule vstřebá, buňka vystaví na svém povrchu bílkovinu Spike a tím spustí imunitní odpověď. USA

BNT162b2 BioNTech/Pfizer, virus SARS-CoV2 - mRNA kódující bílkovinu Spike je chráněna z lipidových nanočástic (jako mýdlová bublina). Jakmile se partikule vstřebá, buňka vystaví na svém povrchu bílkovinu Spike a tím spustí imunitní odpověď. Německo/USA

Ghasemiyeh P et al-, A focused review on technologies, mechanisms, safety, and efficacy ofavailable COVID19-vaccines, International Immunopharmacology 100 (2021) 108162

Počáteční vakcíny měli účinnost 80-90%, ale s přibývajícím časem se měnil samotný virus – vznikaly mutace, tím vznikaly varianty a tím klesala účinnost vakcín. (Zdravotnictví celého světa nemá na to, aby s každou novou variantou vyvíjelo novou vakcínu pro celý svět. A nikdo na světě nemá ty kvality předpovědi mutací u virů).

Historie mRNA vakcíny začala v roce 1978, kdy byl vnesen první lipozom s mRNA viz tabulka. Ten proces je starší než dnešní čtyřicátníci. Studujte tabulku, která je přejata z Naturu ("nejčru").  Nature, Dolgin Elie, The Tangled history of mRNA vaccines, Nature, 597(2), obrázek č. 4 +5

Jen to nejdůležitější:

Rok 1978- první lipozom vnášející mRNA do buňky
1990 - první lipozom s mRNA vnášen do myši
1993 - první mRNA vakcína proti chřipce testována na myši
2013 - první mRNA vakcína v lipidové nanopartikuli testována na myši
2015 - první klinická studie mRNA vakcíny proti chřipce v lipidové nanopartikuli
2020 – autorizace první kovidové vakcíny

Technické postupy nejsou až zas tak důležité, ale celý proces byl vyvíjen pro vakcíny chřipky a pak byl rychle přeorientován na SARS. Psala jsem o rozdílech daných virů, ale v tomto případě šlo o izolaci dané RNA informace ze SARS-CoV-2.

DNA vakcíny

By měli své výhody, ale i svá vážná negativa. V podstatě je to princip genové terapie. Nedočetla jsem se o žádné používané DNA vakcíně. Takže jen stručně. Na přepravu specifické molekuly DNA s informací o antigenní/imunogenní bílkovině by se musely používat vektory s úsekem DNA pro antigen, obrázek č. 6. Vnášely by se nejdříve do bakterií pro pomnožení, bakterie by se překotně a rychle množily, potom by se DNA pro antigen/imunogen izolovala z bakteriální populace, čistila by se gelovou chromatografií nebo gradientovou centrifugací, a dále fenolovou extrakcí. Taková molekula by se vnášela do jádra buňky očkovaného. Velká nevýhoda/nebezpečí by byla inzerční mutageneze (vznik nespecifických mutací), navození tolerance a vyvolání jiného patologického stavu. Vektor při transgenezi a při genové terapii bývá stabilní, replikující se ds DNA molekula, jako jsou bakteriální plazmidy, bacteriofág lambda, kosmidy, BAC, YAC a pro lidskou medicínu viry - adenoviry, retroviry, adeno-asociované viry, lentiviry, baculoviry. Zmiňuji se o tom proto, že tyto viry jsou součástí některých kovidových vakcín a slouží jako nosiči vakcíny do těla. Celý proces manipulace s geny a přenášení DNA začal s objevem restrikčních endonukleáz, kterých je několik stovek, a byly izolovány z bakterií. Za tento objev byla v 1978 udělena W. Arberovi, H. Smithovi a D. Nathansovi Nobelova cena. Takže ani tento postup není mladý, "v plenkách".
Jakmile vnášíte gen/část DNA do jiné molekuly DNA jiného druhu, mluví se o REKOMBINANTNÍ DNA, rekombinantní bílkovině vyjádřené z této molekuly DNA. Pokud se na produktu – bílkovinně podílí víc než jeden organismus jiného druhu, mluvíme o rekombinantních produktech, bílkovinách, vakcínách, léčivech. Slůvko rekombinantní znamená, že jsme využili jiný organismus na produkci námi používaných produktů, nejčastěji léčiv. Ano znamená to manipulaci s genetickou informací, její střihání na specifických místech, vnášení genů do odlišných organismů a ovlivnění podmínek tvorby produktu (času a množství).

https://www.istockphoto.com/cs/vektor/genov%C3%A9-klonov%C3%A1n%C3%AD-dna-rekombinantn%C3%AD-gm1160753777-317822665

Existují

Vakcíny založené na rekombinantních virech a baktériích                                                                        Rekombinantní proteinové vakcíny

Vakcíny založené na rekombinantních virech a baktériích (s virovým nosičem)

Vektory/přenašeči jsou nepatogenní formy virů (adenoviry) a bakterií.  Formy jsou jindy patogenní, ale teď jsou zbavené genů, které předurčují patogenitu a množení. Vakcinace je založena na infikování člověka jiným virem (adenovirem), který vnáší informaci o antigenu/imunogenu z jiného viru (SARS-CoV-2), ale je zbaven všech patogenních genů. V buňkách očkovaného dojde k přepisu a překladu vnášeného antigenu/imunogenu, protein z něj se dostává na povrch buňky a vyvolává imunitní reakci. Přenáší se malé množství cizí DNA do našich buněk, jader!! Je důležité, že vybrané adenoviry pro kovidové vakcíny spontánně nevnášejí DNA do našeho genomu. Kopíruji z anglické verze "adenovirus vectors do not integrate into host genomes but stay as episomal DNA in the nucleus of host cells". Kovidové vakcíny používají nepatogenní adenoviry, které napadají jen plíce a spontánně nenapojují pro nás cizí DNA do našeho genomu (což je nevýhodný aspekt genové terapie). Nabízím postup přípravy adenovirového vektoru pro SARS-CoV2: bakteriální plazmid (1.krok na obr.) s genem pro Spike protein a eukaryotním promotorem, sekvencemi adenoviru a sekvencí pro kontrolovanou homologní rekombinaci (kombinace DNA molekul na přesně definovaných místech) s virovým genomem se přenese do lidské linie buněk 293, která vyprodukuje rekombinantní adenovirovou částici vhodnou k očkování. Další postup je na obrázku č. 7

Ghasemiyeh P et al-, A focused review on technologies, mechanisms, safety, and efficacy of available COVID-19 vaccines, International Immunopharmacology 100 (2021) 108162

Nereplikující se kovidové vakcíny s Adenovirovým nosičem:

ChAdOx1/AZD1222 Oxford/AstraZeneca (Covishield), virus SARS-CoV2 - DNA/gen pro Spike protein je uschován v Adenoviru. Jím se infikují buňky očkovaného a posléze infikované buňky vystavují na svém povrchu bílkovinu/protein Spike a tím spustí imunitní odpověď.

JNJ-78436735/Ad26.COV2.S Johnson&johnson, virus SARS-CoV2 - DNA/gen pro Spike protein je uschován v Adenoviru 26. Jím se infikují buňky očkovaného a posléze infikované buňky vystavují na svém povrchu bílkovinu/protein Spike a tím spustí imunitní odpověď

Gamaleya (Sputnik V), virus SARS-CoV2: gen pro S protein (DNA) + Adenovirus 26 a Adenovirus 5

Tyto vakcíny se podávají jen v jedné dávce, aby se nespouštěla imunitní reakce oproti virovému nosiči – vektoru, v daných případech proti Adenovirům.

Podjednotkové rekombinantní proteinové vakcíny

Dle mého názoru je to nejsložitější typ. Ale tímto způsobem se dnes připravují tuny léčiv jako inzulín, hormóny ..a další bílkovinná léčiva. Příprava rekombinantních léčiv začala v roce 1990, takže to není úplně "nový" způsob. Pro vakcinaci se připravuje, tvoří jedna molekula viru (patogenu) – bílkovinná subjednotka (podjednotka, proto ten typ a název). Proces je založen na přenosu genu/-ů pro tuto bílkovinu do organismu jiného druhu, nebo-li transgenóze. Opět se na přípravě podílejí minimálně dva odlišné druhy, jejich DNA. Producenti rekombinantních vakcinačních proteinů jsou bakterie, pivní kvasinky Sacharomyces. cerevisiae, dále hmyzí buňky s bakuloviry, linie vaječníku křečka čínského, linie myšího myelomu, "baby hamster kidney" linie (buňky infantilních křečcích ledvin) a endotelové buňky z opičích ledvin. Po transgenózi se dané transgenní buňky kultivují, mnohonásobně se s vnesenými geny pomnoží a vytváří se ohromné množství daného produktu, který po izolaci je vakcínou (léčivem) pro nás. Jedna z prvních rekombinantních vakcín byla vakcína proti hepatitidě B, tedy tvorba HBs antigenu dsDNA Hepatitis B viru. Obr. č. 8. Zajímavostí je, že tuto vakcína pro nás produkují pivní kvasinky. Celý proces je pro výrobu každého léčiva/vakcíny jiný dle použitých buněk a samotného antigenu, takže celý postup ukážeme na přípravě HBs antigenové vakcíny. https://www.brainkart.com/article/Applications-of-biotechnology-in-Medicine_38121/

V prvním kroku vyizolujeme gen/DNA pro HBs antigen z Hepatitis B viru, pomocí restrikčních endonukleáz ho zavedeme do bakteriálního plazmidu, spolu s dalšími důležitými DNA částmi. Tím získáme vektor s transgenem, nebo-li rekombinantní DNA. Tuto molekulu vneseme do buněk pivní kvasinky – Sacharomyces cerevisie a necháme ve fermentačním tanku mnohonásobně namnožit. Kvasinky pro nás vytvoří obrovské množství HbBs antigenu, který získáme, čistíme a používáme jako vakcínu.

Př. Rekombinantní podjednotkové vakcíny:

Bexsero, Trumenba proti meningitidě B, Neisseriae meningitidis B: Obsahuje proteiny z povrchu meingokokové bakterie. Tři z těchto proteinů jsou připraveny pomocí rekombinantní technologie. Toto je další typ vakcinační látky proti meningokokům, spolu s mRNA vakcínou a vakcínou proti sacharidové A+C  molekule Neisserie meningitidis-viz I. část.
proti hepatitidě B, dsDNA Hepatitis B virus: vakcína Hbs antigen. Je součástí povinného očkování. 
proti lidskému papilomaviru, dsDNA Papilomavirus: vakcína proti L1 proteinům, nepovinné očkování
proti Varicelle-zoster, dsDNA Varicella-zoster virus: nepovinné očkování pro starší osoby (pásový opar) 
proti chřipce, -ssRNAOrthomyxoviridae, Influenza A, B, C virus, inaktivovaná sezónní tri/tetravalentní vakcína s imunogenními bílkovinami  - hemaglutinin a neuraminidáza 
NovaVax, NXX-CoV2373, SARS-Cov-2 : podjednotková vakcína s S-proteinem viz obr. č.6. Gen pro Spike protein se zavede do vektoru, v tomto případě do Bakuloviru (hmyzí viry), posléze se kultivuje na hmyzích buňkách/kultuře, tvoří S protein, ten se potom extrahuje, čistí a po spojení s nanočásticemi se používá jako vakcína.

 Ghasemiyeh P et al-, A focused review on technologies, mechanisms, safety, and efficacy of available COVID-19 vaccines, International Immunopharmacology 100 (2021) 108162

Na webseminářích na téma COVID-19 pro lékaře v lednu 2021 jsem se dozvěděla o typech vakcín, jejich účinnosti a vedlejších účincích:

Všechny vakcíny fungovaly, vyvolávaly imunitní reakci.
mRNA vakcíny vyvolávaly lokální i systémové vedlejší účinky: myalgie (bolest svalů), artralgie (bolest kloubů), zimnice a bolest hlavy: viz nahoře v textu…..to se potvrdilo.
Inaktivované vakcíny z Číny, Indie měly ze všech nejméně vedlejších účinků, vznikaly protilátky proti všem proteinům SARS-CoV-2 (S, M, E, N) : WIBP/BIBP vaccine, BBIBP-CorV Sinopharm, Sinovac CoronaVac, Bharat Biotech Int. COVAXIN (Indie). Ty jsme nekoupily (Česká republika).
nereplikační Ad-vakcíny měly 40-60% lokální a systémové vedlejší účinky, 3 závažné případy! CanSino Biologics Ad5-nCoV rekombinantní, Janssen Pharmaceutica Ad26.COV2.S, Sputnik V (Gam-COVID-Vac), Astra Zeneca ChAdOxnCoV-19 (AZD1222)
subjenotkové vakcíny: protilátky proti S proteinu, 60% lokální vedlejší účinky, po 2 dávce lokální a systémové: myalgie, bolest hlavy až 50%, horečka, Novavax NVX-CoV2373 ….dejte mi prosím vědět, zda jste takové příznaky měli.

Vzhledem k těmto informacím a vzhledem k faktu, že se mi osobně nelíbí, když se jeden virus vyhání druhým (nereplikační Ad-vakcína=rekombinantní s virovým nosičem), jsem došla k závěru, že nejlepší očkování proti kovidu v dané chvíli bude mRNA vakcínou.

Seznam dalších nepovinných vakcín
Inaktivovaná vakcína proti viru klíšťové meningoencefalitidis,+ssRNA Flavivirus
Inaktivovaná vakcína proti virus žluté zimnice, +ssRNA Flavivirus,
Inaktivovaná vakcína proti virus japonské encephalitidis, +ssRNA Flavivirus,
Atenuovaná vakcína proti Rotaviru, dsRNA virus

Inaktivace a atenuace je vysvětlena v I. části – "Jak se připravují klasické vakcíny"

Obsah očkovací látky

• Antigen/imunogen
• Konzervační látky: Nejčastěji používaným konzervantem je 2-fenoxyethanol. Používá se již mnoho let v řadě vakcín, používá se v řadě výrobků pro péči o děti a je bezpečný pro použití ve vakcínách, protože je pro člověka málo toxický.
• Stabilizátory mohou být cukry (laktóza, sacharóza), aminokyseliny (glycin), želatina a proteiny (rekombinantní lidský albumin).
• Povrchově aktivní látky: udržují všechny složky ve vakcíně smíchané dohromady. Zabraňují usazování a shlukování prvků, které jsou v tekuté formě vakcíny. Často se také používají v potravinách, jako je zmrzlina.
• Adjuvans: zlepšuje imunitní odpověď na vakcínu, někdy způsobuje ponechání vakcíny v místě vpichu o něco déle nebo stimulací místních imunitních buněk. Adjuvans může být malé množství hliníkových solí (jako je fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý nebo síran hlinitodraselný). Ukázalo se, že hliník nezpůsobuje žádné dlouhodobé zdravotní problémy a lidé ho pravidelně přijímají jídlem a pitím

Ve vakcínách proti SARS-Cov-2, v žádné z nich, hliník obsažen není. https://www.reuters.com/article/uk-factcheck-covid-vaccine-ingredients-idUSKBN2AQ2SW

Vakcína Pfizer-BioNtech: Informační list na webových stránkách FDA popisuje, že zahrnuje mRNA, lipidy, chlorid draselný, dihydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, dihydrát hydrogenfosforečnanu sodného a sacharózu.

Vakcína Moderna zahrnuje mRNA, lipidy, cholesterol, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholin, tromethamin, tromethamin hydrochlorid, kyselinu octovou, octan sodný a sacharózu.

Vakcíny proti SARS-CoV-2, které byly schváleny pro nouzové použití ve Spojených státech, neobsahují žádný hliník. Ani vakcíny AstraZeneca, Johnson & Johnson nebo Sputnik V.

Testování vakcín v klinických studií – převzato z WHO https://www.youtube.com/watch?v=mvA9gs5gxNY

• Experimentální vakcína je nejprve testována na zvířatech, aby se vyhodnotila její bezpečnost a potenciál k prevenci onemocnění. Pokud vakcína vyvolá imunitní odpověď, je následně testována v klinických studiích na lidech ve třech fázích.
• Fáze 1: Vakcína se podá malému počtu dobrovolníků, aby se posoudila její bezpečnost, potvrdilo se, že vyvolává imunitní odpověď, a určila se správná dávka. Obecně jsou v této fázi vakcíny testovány na mladých, zdravých dospělých dobrovolnících, pro které nebyla vakcína určena,
• Fáze 2: Vakcína je poté podána několika stovkám dobrovolníků k dalšímu posouzení její bezpečnosti a schopnosti vyvolat imunitní odpověď. Účastníci této fáze mají stejné vlastnosti (jako je věk, pohlaví) jako lidé, pro které je vakcína určena. V této fázi se obvykle provádí několik studií, které zhodnotí různé věkové skupiny a různé varianty ohledně vakcíny.
• Fáze 3: Vakcína je následně podána tisícům dobrovolníků, a také podobné skupině lidí, kteří nedostanou vakcínu, ale dostanou negativní kontrolu, aby se zjistilo, jaké jsou vedlješí účinky, zda je vakcína účinná proti onemocnění, proti kterému je navržena, a zda je bezpečná pro mnohem větší skupinu lidí. Studie probíhají ve více zemích a na více místech v rámci země, aby se zajistilo, že zjištění účinnosti vakcíny platí pro mnoho různých populací.

               Během 2. a 3. fáze ani vědci, ani dobrovolníci nevědí, co dostanou, zda negativní kontrolu nebo vakcínu.

Použitá literatura:
Očkování dospělých: Chlíbek, Roman, 1965-2019
Očkování u dětí: spolupráce specialistů a primární péče, Cabrnochová, Hana, 1965-; Lebl, Jan, 1955-; Roháčová, Hana, 1954-; Bronský, Jiří, 1977-; Keslová, Petra; Kosina, Pavel; Rumlarová, Šárka; Sedláček, Petr, 1963-; Škovránková, Jitka, 1948-2020
Očkování: minulost, přítomnost, budoucnost, Beran, Jiří, 1960-; Havlík, Jiří, 1928-2011; Vonka, Vladimír, 1930-2
IPVZ č. 207002103: Webinář – Covid-19 nejen v datech
č. 203111279: Mimořádný webinář – Akutní respirační infekce a covid-19 v ambulantní praxi 
č. 03111280: Mimořádný webinář - Aktuálně o covid-19 pohledem medicíny založené na důkazech
č.  203121101: Webinář – Aktuálně o covid-19: novinky v epidemiologii, terapii a očkování, 3.2.2022
č. 203121101: Webinář – Aktuálně o covid-19: novinky v epidemiologii, terapii a očkování,15.3.2022

Publikace: 
https://www.who.int/news-room/feature-stories/detail/how-are-vaccines-developed https://www.who.int/news-room/feature-stories/detail/manufacturing-safety-and-quality-control
https://www.sciencedirect.com/search?qs=development%20of%20vaccinehttps://www.un.org/sustainabledevelopment/blog/2017/04/world-immunization-week-power-of-vaccines-still-not-fully-utilized-says-un-health-agency/